Circulation：细胞外囊泡在心血管疾病中的治疗和诊断转化

外泌体是细胞主动分泌的内吞来源的小膜囊泡。先前已经研究了外泌体作为心肌信号中生物信号有效沟通者的潜力，最近在外泌体研究的突飞猛进不仅突显了它们在心脏生理学和病理学中的重要性，而且引起了人们对研究这些细胞外囊泡的方法学局限性的关注。这篇综述讨论了外泌体研究的最新进展和挑战，重点是分离、鉴定和表征方法学方面的科学创新，并提供了该领域网络资源的全面总结。重要的是，关注了外泌体的生物学和功能，强调其在心血管病理生理中的基本作用，以进一步支持外泌体作为心血管疾病的生物标志物和治疗剂的潜在应用。

囊泡世界

EVs的分类

已知从细胞释放的以及在循环的生物流体中发现的EV群体在来源、大小和组成上都是异质的。目前尚无关于EV术语的金标准。但是，普遍的共识是，直接从细胞质膜释放的某些EV通常称为微泡或囊泡。这些EV的尺寸范围从几纳米到微米。在多囊泡内体区室中产生的内部囊泡称为外泌体，其通过多囊泡体膜与质膜的融合而分泌。外泌体直径通常小于150 nm，并包含与内体相关的蛋白质。然而，术语外泌体在文献中更普遍地用于小尺寸异质性群体。通过超速离心方法或尺寸排阻过滤器分离出的大尺寸EV，而没有证明其细胞内起源。外泌体本身也被认为是非常异质的群体。有趣的是，最近发现了数量众多的非膜（非囊泡）纳米颗粒，称为外泌颗粒（exomeres，约35 nm）。微囊泡较大的（约100 nm及更大）质膜来源的囊泡。凋亡小体起源于细胞凋亡，也是大型囊泡（≈50–500nm）。该综述将外泌体和微囊泡作为主要的EV类别，并将其作为治疗心血管疾病的潜在治疗手段。与其他细胞外囊泡（如微囊泡和凋亡小体）相比，图1给出了外泌体生物发生及其基本特征的示意图。

图1. 各种细胞外囊泡（例如微囊泡、外泌体和凋亡小体）的形成、表征和分泌。蓝色表示细胞外区室；红色表示细胞内区室；黄色表示酸性隔室。细胞器比例不成比例。EV表示细胞外囊泡；ILV，腔内囊泡；L，溶酶体；MVB，多囊泡体；PM，质膜；RER，粗面内质网；TGN，反式高尔基体网络。

外泌体：心血管信号中的关键成员

鉴于人们越来越关注外泌体在心血管生理学和病理学中的作用，该文总结了关于外泌体作为与心血管医学相关的信号传导介质、生物标志物和潜在治疗靶标的作用的最新发现。此外，本综述提供了关于外泌体研究的最新方法学进展的全面更新，并希望对目前活跃在外泌体研究中的研究人员以及最近的科学新手有价值。

然而，在探索外泌体的不同方面之前，值得解释为什么外泌体在心血管领域获得了如此大的兴趣：

1. 外泌体是EV的一个子类，是细胞在生理和病理条件下均能主动释放的纳米级膜颗粒。

2. 外泌体介导胞质货物的细胞间运输。

3. 外泌体为临床领域提供了巨大的潜力，可应用于诊断和治疗领域。

外泌体分离的新视野

外泌体分离初学者指南

体积小、数量少、理化性质不同以及周围生物流体的复杂性，使得难以获得相对纯的外泌体。将外泌体与其他细胞外实体和囊泡亚型分离是一项重大挑战，主要是因为缺乏通用的或明确的基于外泌体的标记物。

已经描述了多种不同的分离方法，这些方法会影响不同程度的EV纯度、完整性和活性状态以及产量。因为目前尚无单一的最佳分离方法可实现实验和临床上的外泌体分离或鉴定需要，为外泌体研究选择合适的方法可能是一个具有挑战性的决定。

不要遵循常规：选择分离方法时的注意事项

分离方法的选择应遵循含外泌体基质的类型以及下游应用和需要解决的科学问题所决定的外泌体产量、纯度、完整性和浓度要求的程度。

了解您的样品并当心污染物

考虑下游的实验/应用

黄金标准及更好的方法

当前正在使用多种外泌体分离方法，每种方法都有其自身的优点和缺点。传统上，基于离心和基于大小的外泌体分离方法被广泛的研究人员所采用，但是现代科学技术的飞速发展已经开始产生许多新的技术，以定量和定性地改善外泌体分离。

从组织中分离外泌体

均质化

基于酶的轻度组织解离

组织破裂

临床级外泌体

深入研究外泌体生物学

外泌体组成

蛋白质

独特的还是富含的

寻找外泌体标志物

RNA

拷贝数

长链非编码RNAs

EVs中被修饰的RNA

脂质

已知的、新的和可能的惊喜：独特的外泌体货物

病毒和病毒成分

基因组和线粒体组分

外泌体摄取的机制

促进外泌体研究的工具

本部分的目的是列出并使读者了解各种可用的基于Web的资源，这些资源整合了我们的外泌体生物学知识并提供了不同囊泡分子的数据库。

网络资源

EV Flow Cytometry Working Group

The EV Flow CytometryWorking Group (http://www.evflowcytometry.org)

心脏外泌体：健康和疾病的使者

外泌体被证明是与心肌功能有关的生物信号的有效沟通者（图2）。该文描述了外泌体衍生的分子（主要是microRNA和蛋白质）在健康和疾病中对心脏功能的影响，以支持将心脏外泌体作为生物标记物或治疗剂的潜在应用。

图2. EV介导的心脏局部和远端通信的机制。心脏内的局部交流是通过不同细胞类型之间的串扰通过EV分泌介导的，如箭头所示（旁分泌方式）。不同的心脏细胞类型会分泌EV，这些EV也可能以自分泌方式发挥作用，从而影响释放小泡的同一细胞。另一方面，远距离的交流是由EV从心肌向系统循环的分泌介导的，介导了心脏与其他器官（例如，骨髓）之间的功能性串扰。心肌的局部和远端通讯涉及通过内吞、膜融合或间隙连接介导的转移在细胞之间通过EV穿梭的蛋白质、脂质和核酸的交换。EV发挥作用的机制还包括受体介导的信号传导，导致靶细胞中转录和转录后过程的调控。由于这些功能，EV被证明是有效的生物信号传递者，涉及正常心脏生理以及疾病中控制心脏功能的多个过程。CM表示心肌细胞；CSC，心脏干细胞；EV，细胞外囊泡。

自己的运动场上的心脏外泌体：心内通讯

心肌细胞外泌体Cardiosomes

成纤维细胞外泌体

内皮细胞外泌体

其它心脏外泌体

永生化细胞系可扩大EV产量

远距离关系中的心脏外泌体：心脏与周围器官之间的串扰

循环外泌体

SOS信号传递给骨髓细胞

释放心脏外泌体研究的手刹

缺乏用于外泌体分离和表征的通用技术和标准协议

缺乏通用的外泌体标志物

外泌体包装和内化机制不清

体内和体外实验的方法论问题

心血管疾病的诊断和治疗新方法

外泌体诊断

外泌体是一种宝贵的生物医学工具，因为它们的分子含量是释放细胞类型及其生理状态的“指纹”，并且因为它们是在容易接近的体液（例如血液和尿液）中检测到的（图3）。

图3. EV诊断和基于EV的疗法的各种策略。诊断：EV从其宿主细胞中携带生物活性分子，这些生物活性分子可指示病理生理状况，并且它们被认为对于临床诊断的生物标志物发现至关重要。治疗：可以直接从体液和组织中分离出EV，也可以从体外培养的细胞中间接分离出EV。通过基因或代谢工程进行的细胞修饰可以导致修饰的EV的释放。或者，可以使用化学处理或脚手架策略直接修改EV。BAL表示支气管肺泡灌洗；EV，细胞外囊泡。

外泌体治疗

当您有太多选择时如何选择：治疗性外泌体的来源

基于外泌体疗法的策略

为了将外泌体用作治疗剂，可以对囊泡进行外源性改造和修饰以用作药物递送工具，或者可以将其本身用作活性药物。

外泌体生产

细胞或直接外泌体修饰

组织工程中的外泌体

外泌体未来心脏治疗的关键方面

优点

值得强调的是，无生命但具有生物活性的外泌体可以发挥独特的生物活性，反映其细胞起源，这可能潜在地应用于心血管治疗。外泌体比亲代细胞更小、更简单、更稳定、并且相对容易修饰、制造和储存。由于其性质，具有膜的外泌体可提供保护，使其分子内容免遭酶促和非酶促降解，与直接移植细胞相比，可能具有更低的致瘤性和免疫原性。

缺点

外泌体在递送部位内和周围被细胞相对快速地内化，常常进入非特异性细胞类型以及全身循环。因此，开发基于外泌体的疗法的主要挑战是确定是否针对组织内特定细胞类型的定制囊泡。评估基于外泌体的疗法在临床环境中的安全性，研究其生物分布、毒性、血栓形成和半衰期非常重要。在这一行中，应鼓励使用大型动物模型（相对于啮齿动物模型）进行外泌体治疗效果的临床前测试，并仔细考虑临床转化。此外，必须确定小心的外泌体剂量和给药方案，以及开发有效囊泡给药的最佳方法。在将外泌体带入临床之前，同样重要的是要确保在符合临床要求的推荐安全水平下大规模供应外泌体是可行的。重要的是要找到可靠的来源来获得大量的外泌体生产，以提高临床级纯度的整体外泌体产量（例如，通过对生产细胞的基因改造或响应外部压力的外泌体生产）。

外泌体临床试验

在https://www.clinicaltrials.gov上进行的搜索发现了95项涉及外泌体或细胞外囊泡或微囊泡的介入性临床试验（包括招募和尚未招募）。

参考文献：

Sahoo S, Adamiak M, Mathiyalagan P,Kenneweg F, Kafert-Kasting S, Thum T. Therapeutic and Diagnostic Translationof Extracellular Vesicles in Cardiovascular Diseases: Roadmap to the Clinic.Circulation. 2021 Apr 6;143(14):1426-1449. PMID: 33819075.

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