今天带来的文献题目是：“Tumor Microenvironment Derived Exosomes Pleiotropically Modulate Cancer Cell Metabolism”，发表在“Elife”杂志上，影响因子是9.322。闲话不多说，直入主题——肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts, CAF）是大多数实体肿瘤的肿瘤微环境的主要组成成分，作者发现病人来源的CAF分泌的外泌体可以重建其代谢机制，在他们被癌症细胞摄取后。他们发现CAF来源的外泌体（CDEs）抑制了mitochondrialoxidative phosphorylation（线粒体氧化磷酸化），因此增加了糖酵解、和glutamine-dependentreductive carboxylation(谷氨酰胺)依赖的还原羧化作用。通过13C标记的同位素标记实验中，阐明了外泌体提供氨基酸给营养被剥夺的癌症细胞，用一种类似巨吞的机制，尽管没有先前描述的依赖于癌基因Kras信号。利用外泌体导入机制，作者提供了足够充足的证据，CDEs包含完整的代谢产物，包含氨基酸、脂质、和TCA循环中间体，这些被癌症细胞如饥似渴地利用，在营养缺乏和压力环境下帮助肿瘤成长。文章的结论显著的体现了不是只有外泌体可以增强“Warburg effect”（即使在有氧条件下肿瘤细胞仍主要利用糖酵解供能,这种现象称为瓦博格效应），并且包括从头现成代谢产物，以及他们的携带物，这可以导致整个肿瘤细胞的中央碳代谢。阻断这些CDEs引导的代谢适应，可能可以提供一种新的可供开发的治疗策略。
INTRODUCTION 理解癌症细胞和肿瘤微环境的相互作用的机制对于治疗的发展是非常重要的，最近的研究已经证实肿瘤微环境是一个调节癌症细胞生长的重要因子。虽然肿瘤微环境是由多种细胞类型，包括CAFs，免疫细胞，和血管生成的元素，CAF是大多数癌症中组成肿瘤微环境的主要组成部分。证据表明癌症细胞的旁分泌信号可以招募CAF并在肿瘤微环境中激活。虽然CAF与肿瘤发生发展密切相关，并且通过胞间联系进行转移，但是我们对他们在癌症细胞代谢和重建的过程中扮演怎样的角色还所知甚少。
研究发现胞外囊泡（被认为是外泌体）可以促进癌症和基质细胞之间的串扰。外泌体被认为是肿瘤微环境的不同细胞之间重要联系机制。外泌体承载一个细胞的信息到另外一个并重建受体细胞，且最近研究报道外泌体具备有调节受体细胞增殖、生存和免疫效能状态的潜力。外泌体直径大约有30-100nm的，有双层膜并且表达表面标记物比如CD63。最近的研究指出外泌体包含蛋白，核酸和miRNA。大多数的研究把重点都放在癌症细胞分泌的外泌体上，但是很少有研究关于CAF相关外泌体和其对癌症细胞的代谢影响。虽然CAFs可以诱导癌症细胞的代谢重建，CDEs在形成该环境的作用，这些都还未被阐明。这里，作者报道了CDEs在前列腺和胰腺癌的癌症细胞中介导调节的机制。
Figure 1. Exosomes secreted by CAF-derived fromprostate cancer patients are internalized by prostate cancer cells.前列腺癌病人的肿瘤相关成纤维细胞分泌的外泌体被前列腺癌细胞内化。
图1A：基质外泌体的大小分析。来自三位前列腺患者CAF的外泌体样本，用Zetaview仪器分析其粒度。该图指出外泌体的大小范围集中在30-100nm。B：将CAF的外泌体与抗CD63抗体和不相关对照抗体进行结合，进行流式分析。C:流式细胞仪分析被前列腺癌细胞吸收的CAF外泌体，用PKH标记外泌体。D：荧光图像显示的CAF外泌体是由前列腺癌细胞摄取。E：流式细胞仪展示前列腺病人CAFs所分泌外泌体的饱和吸收曲线。
Figure 2. CDEs increase proliferation ofprostate cancer cells but significantly downregulate their mitochondrial function.
CDEs促进了前列腺癌细胞的增殖，但是显著地调低了其线粒体功能。
图2A：CAF分泌的外泌体对前列腺癌细胞活力的效果。B：当与CDEs共同培育24h后，前列腺癌症细胞降低了基础线粒体耗氧率(OCR)。C：用PC3,DU145, 22RV1, E006AA这几种前列腺癌细胞系与CDEs培养，测量OCR。D：测量前列腺癌细胞与或不与CDEs培养的OCR值，再用一种细胞松弛素D（抑制外泌体通过肌动蛋白解聚液吸收），它可以用来抵抗因与CDEs培养而减少的OCR值。E：通过FCCP（呼吸链解偶联剂）和抗霉素测量线粒体最大能力和储备能力。F：癌症相关成纤维细胞分泌的外泌体在调节线粒体膜电位(MMP)中的作用。G：与外源性CDES培养减少癌症细胞中OXPHOS基因的表达。H:qPCR的结果显示前列腺癌细胞线粒体OXPHOS基因在与CDEs培养后下调。I：OXPHOS基因最丰富的miRNA在CAF分泌的外泌体里也同样丰富。J：CAF外泌体中的miRNA与OXPHOS基因特异的miRNA保持一致。K：将miRNA转染到细胞后检测其OCR。
Figure 3. CDEs upregulateglycolysis in cancer cells.肿瘤相关成纤维细胞的外泌体上调了肿瘤细胞的糖酵解功能。
图3A：测量前列腺癌细胞与或不与CAFsexosome培养24h后的胞外酸化率（ECAR）。使用四种前列腺癌细胞系：PC3, DU145, 22RV1, E006AA。B：测量前列腺癌细胞的ECAR。C、D：CAF分泌的外泌体摄取糖和乳酸分泌量的效果。E：1:1 混合13C6 glucose与13C1-labeled glucose的原子跃迁图。F：有或没有CAF分泌的外泌体时测得的相对乳酸丰度。G-M：比较PC3肿瘤细胞中乳酸，丙酮酸，柠檬酸，α酮戊二酸，苹果酸盐，富马酸盐，和谷氨酸的mass isotopologue distributions (MID)。N：比较与或不与CAF分泌的外泌体共同培养的PC3细胞其葡萄糖贡献给α-酮戊二酸的百分比。
Figure 4. CDEs increase glutamine driven reductivecarboxylation and lipogenesis in prostate cancer cells.肿瘤相关成纤维细胞分泌的外泌体增加前列腺癌细胞谷氨酰胺驱动还原羧化和脂肪生成。
图4A：使用13C5谷氨酰胺碳原子转换示意图。B-F：PC3肿瘤细胞与或不与CDEs培养其谷氨酸，α酮戊二酸，柠檬酸盐，苹果酸盐的（MID），和富马酸盐的Mass isotopologue distribution(MID)。G：PC3肿瘤细胞与或不与CDEs培养，用GC-MS测量的α酮戊二酸的比率，较高的比率与较高的谷氨酰胺驱动还原羧化有关。H-I：通过氧化和还原途径中，谷氨酰胺转化到柠檬酸的贡献率，较低的比率表明较高的还原羧化。CDEs增强了在PC3细胞中还原性谷氨酰胺的代谢。J：使用GC-MS测量PC3细胞中葡萄糖贡献棕榈酸酯的合成，分别与或不与CDEs培养72h。K：用GC-MS测量谷氨酰胺贡献棕榈酸酯的合成，分别与或不与CDEs培养。L：在PC3细胞中（与或不与CDE培养）用Isotopologue spectral analysis (ISA同位素频谱分析)分析葡萄糖和谷氨酰胺共同促进脂质合成的贡献。M：在癌症细胞培养基中的醋酸浓度。N：在PC3细胞有或无CAF的外泌体，测量醋酸在棕榈酸合成中的贡献。O： PC3细胞与或不与CAF的外泌体培养，测量丙酮酸在棕榈酸合成中的贡献。P：通过ISA同时测量醋酸、丙酮酸在棕榈酸合成中的贡献，与或不与CAF的外泌体共同培养。
Figure 5. Prostate and pancreatic CAFs secretedexosomes carry metabolite cargo.前列腺和胰腺的CAF分泌的外泌体携带有代谢产物。
图5A、B：用enzymatic assays（酶测定法）测量前列腺癌和胰腺癌患者的外泌体内部乳酸和醋酸盐。C: 在胰腺CAF35分离的外泌体用GC-MS测量发现TCA循环代谢产物，包括丙酮酸，柠檬酸，α - 酮戊二酸，富马酸和苹果酸。D、E：采用超高效液相色谱（UPLC）在CDE中测定其氨基酸。F-G：用GC-MS将胰腺和前列腺的CDE中测得高水平的硬脂酸和棕榈酸。
Figure 6. CDEs supplymetabolites to cancer cells.（CDE提供代谢产物给癌症细胞）。
图6A：PC3细胞和标记的CDE培养后，观察其有标记的百分比。B：通过同位素标记筛选TCA循环代谢产物中质量分数最高，分别在完全培养基或者剥夺某种营养素的条件下。C：CDE对PC3细胞活力的影响。D：EIPA(25μM) 可以阻止在剥夺营养条件下PC3细胞活力的减少现象。
Figure7.Pancreatic CDEs' metabolic reprogramming of pancreatic cancer cells is Kras independent.胰腺癌细胞CDE的代谢重建依赖于Kras基因。
图7A：胰腺癌的CDE在胰腺癌细胞活力的影响。B-C：肝素可以抑制外泌体的摄取，所以抑制外泌体引起的增殖。D：CAF19的外泌体下调BxPC3 和 MiaPaCa-2的最大OCR与储备OCR。 E：CAF19 的外泌体上调BxPC3 和MiaPaCa-2的外酸化率（Extracellular acidification rates ，ECR）。F：用GC-MS测量BxPC3 和 MiaPaCa-2 细胞相对乳酸丰度。G：在BxPC3和的MiaPaCa-2细胞中，葡萄糖参与产生的α酮戊二酸的比例。H：胰腺CDEs增加野生型还原代谢谷氨酰胺和活化Kras表达的胰腺癌细胞。I：野生型和激活Kras的表达胰腺癌细胞与CAF19分泌的外泌体培养，计算氧化和还原谷氨酰胺贡献生成柠檬酸的比值。J：在BxPC3 和MiaPaCa-2癌细胞中谷氨酸，α酮戊二酸，柠檬酸盐，苹果酸盐，和富马酸的同位素质量分布。
随后作者给出了本篇文章的概括总图，展示了CDEs是如何对癌细胞代谢产生影响，将外泌体和癌细胞代谢相关的各类产物之间的机制展示得很完整。
Figure 8. Pleiotropicregulation of cancer cell metabolism by CDEs.通过肿瘤相关成纤维细胞的外泌体多效地调控癌细胞的代谢。
此图显示CDEs通过抑制氧化磷酸化和提供代谢产物来代谢调控癌细胞。这一规则导致还原谷氨酰胺代谢显著上升。CDEs同时也是氨基酸，TCA循环代谢物，和脂类的运载体。在营养匮乏时，利用丰富代谢产物提供给肿瘤细胞，从而促进肿瘤生长。
参考文献：Zhao H, Yang L, Baddour J.Tumor microenvironment derived exosomes pleiotropically modulate cancer cell metabolism.Elife. 2016 Feb 27;5. pii: e10250. doi: 10.7554/eLife.10250.
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