肝细胞癌(HCC)的早期检测工具并不理想，迫切需要可用的生物标志物。细胞外囊泡(EV)参与肿瘤的发生和转移，引起了越来越多的研究兴趣；然而，大多数基于细胞外RNA(exRNA)的生物标志物研究仅限于带注释的基因组区域。Gut杂志上一篇文章使用一种新方法可重复地量化和表征了来自循环EV有效载荷的未注释小RNA表达特征，大部分是此前未探索的，研究确定了能够高精度检测早期HCC的未注释生物标志物。
细胞外囊泡(EVs)，包括微囊泡和外泌体，是纳米级颗粒，可传递核酸至受体细胞以改变关键的细胞功能。EVs在生物发生和组分方面都是异质的。而较大的EVs，如凋亡小体大多含有片段化的DNA，较小的EV，例如外泌体，富含非编码的调节性小RNA。在癌症中，EV越来越被认为是肿瘤发生和转移的关键参与者，主要通过微小RNA(miRNA)运输，重要的是，大多数表征细胞外RNA(exRNA)和研究EV相关生物标志物的研究应用传统的、基于参考的RNA测序方法，因此仅限于已知的注释基因组区域，例如miRNA、小核仁RNA（snoRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）等。然而，小RNA来自数以千计的内源性基因，是高丰度但基本上未表征的非编码RNA的基因组“暗物质”的一部分，在转录后和翻译机制调节基因表达方面发挥着新的作用。事实上，在这种情况下，对循环EV小RNA及其前体的一般表达图谱特征的关注相对较少，尤其是对于那些从未注释的基因组区域表达的。
肝癌的5年生存率为18%，是仅次于胰腺癌的第二大致命恶性肿瘤。预计到2030年，全球将有超过100万人死于这种癌症。参加肝细胞癌(HCC，最常见的原发性肝癌形式)早期检测计划的患者的存活率是未参加监测的患者的两倍。然而，在美国，HCC高危患者的监测实施率非常低(20%)，并且推荐的监测工具（即超声和血清甲胎蛋白(AFP)）的性能欠佳，灵敏度低(63%)和特异性一般(83%)，会漏诊早期HCC接近40%的肿瘤。迫切需要通过开发更好的肿瘤发生read-outs和促进通过微创、不依赖操作员进行监测来帮助该领域改进。
该研究目标是表征与循环EV相关的小exRNA表达谱，确定新的小RNA生物标志物候选者，并测试它们在高危患者中检测早期HCC的临床效用。与之前的exRNA表征研究截然不同，之前的研究仅限于量化已知（即注释）转录本的表达，该研究采用不同的方法通过从头组装和表征exRNA的小RNA表达谱，特别包括HCC血浆EV数据集和前列腺癌肿瘤、邻近组织、尿液和血液样本的数据集重叠的未注释的基因组区域。后一个数据集用于定义称为小RNA簇(smRC)的离散位点，描绘它们的关键基因组特性并量化它们在生物流体和分离技术中的可重复性。在研究的第二部分，在2期生物标志物病例对照研究的背景下，两个独立的HCC队列被用于识别和验证潜在候选者，以区分早期HCC和高风险对照。总之，通过使用EV相关exRNA的全RNA测序，将循环exRNA中新的临床相关smRCs描述为生物标志物发现的未知来源。与对当前超声±AFP监测标准的meta分析相比，3-smRC特征能够区分早期HCC患者和HCC高危患者，并具有更好的表现。
样本分布的研究概要和流程图
研究目的：早期肝细胞癌(HCC)检测的监测工具并不理想，迫切需要生物标志物。细胞外囊泡(EV)由于参与肿瘤的发生和转移而引起了越来越多的科学兴趣；然而，大多数基于细胞外RNA(exRNA)血液的生物标志物研究仅限于带注释的基因组区域。
研究设计：EVs是通过差速超速离心和集成纳米级确定性横向位移阵列(nanoDLD)分离的，并且通过电子显微镜、免疫印迹、纳米粒子跟踪和去卷积分析评估质量。对大部分未探索的小exRNA进行全基因组测序，包括未注释的转录本，识别并可重复量化的小RNA簇(smRC)。它们的关键基因组特征在前列腺癌和HCC的生物样本和EV分离技术中进行了描述。该研究使用了三个独立的exRNA癌症数据集，其中包括来自375名患者的总共479个样本，包括纵向样本。
从人血液样本中提取exRNA的EV富集过程的质量评估
研究结果：ExRNAsmRCs以未表征、未注释的小RNA为主，其共有序列为20nt。未注释的3-smRC特征在HCC患者的血浆exRNA中显著过表达（p<0.01，n=157）。一项2期生物标志物病例对照研究的独立验证显示，从高危对照(n=209)中检测早期HCC的敏感性为86%，特异性为91%（AUC：0.87）。3-smRC特征独立于甲胎蛋白(p<0.0001)，复合模型的AUC增加到0.93。
3-smRC特征在2期生物标志物病例对照研究中的表现
研究结论：这些发现直接展示了用于HCC监测的微创、仅血液、独立于操作员的临床工具的前景，突出了未注释的smRC在癌症生物标志物研究中的潜力。
文献：von Felden J, et al.Unannotated small RNA clusters associated with circulating extracellularvesicles detect early stage liver cancer. Gut. 2021Jul 28:gutjnl-2021-325036. doi: 10.1136/gutjnl-2021-325036. PMID: 34321221.
