鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma, NPC）是发生在鼻咽上皮部位的一种恶性肿瘤，其具有无明显早期症状、肿瘤部位隐匿、传统组织活检的高侵袭性、临床成像技术的低特异性，且易与慢性鼻炎（chronic nasopharyngitis, NPG）这一良性疾病相混淆，因此鼻咽癌的早期诊断一直是该领域中亟待解决的问题。超过95%的鼻咽癌患者会感染EB病毒（Epstain-Barr virus, EBV），因此一些病毒产物如EBV IgA抗体、EBV DNA及EBV miRNA等已被作为液体活检指标应用于NPC的早期筛查当中。然而，由于EBV IgA检测特异度较低，EBV DNA检测灵敏度较低，仍无法在NPC中实现准确的快速诊断。因此寻找一种更灵敏、准确的新型液体活检标志物来实现鼻咽癌的早期诊断、区分鼻咽癌和鼻咽炎患者是该领域中需迫切解决的问题。近日，厦门大学化学化工学院的颜晓梅教授研究团队创新性地使用表达EBV编码的膜蛋白LMP1和LMP2A（latent membrane protein 1/2A）的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs，40-1000 nm）作为鼻咽癌的液体活检标志物，联合使用其他肿瘤标志物实现了鼻咽癌的早期诊断。该研究成果以“Noninvasive Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma Based on Phenotypic Profiling of Viral and Tumor Markers on Plasma Extracellular Vesicles”为题发表在了Anal Chem杂志上 (doi: 10.1021/acs.analchem.2c01311)。与传统的集权平均分析技术相比，该团队使用的纳米流式检测技术（nano-flow cytometry, nFCM）可对粒径低至40 nm 的单个EVs进行多参数定量分析，并在表征EVs的低拷贝蛋白方面具有巨大优势。因此该技术可对血浆中表达特定蛋白的EV颗粒浓度进行准确定量，可用于甄别鼻咽癌、鼻咽炎及健康人的标志物或标志物组，进行鼻咽癌早期诊断。
EBV感染宿主细胞后可使其表达两种膜蛋白LMP1/LMP2A，因此作者首先选择了携带EBV的鼻咽癌细胞C666-1以及永生化的正常鼻咽上皮细胞NP69作为细胞模型，对两种细胞及其EVs上的LMP1/LMP2A蛋白进行了表征。结果证明，相比于正常对照，LMP1和LMP2A在C666-1细胞及其EVs中都具有更高的表达水平。
为了进一步验证LMP1/LMP2A的特异性，作者新增了五种其他癌细胞系（包含不携带EBV的NPC细胞系CNE1），并对六种癌细胞系来源的EVs上的八种膜蛋白（包含2种病毒膜蛋白、3种肿瘤标志物及3种EVs标志物）的表达比例进行了表征。结果表明，与其他癌细胞EVs相比，LMP1/LMP2A仅在C666-1 EVs上高表达；与其他蛋白分子相比，LMP1/LMP2A能够最大程度的体现EBV+鼻咽癌细胞系EVs与其他癌细胞系EVs的差异（p值均< 0.001），有望应用于后续鼻咽癌的临床诊断中。
随后，根据选择的标志物，作者利用nFCM表征了42例已知具体临床分期的NPC患者（15例早期NPC，27例晚期NPC）及40例健康人的血浆中表达五种膜蛋白的EVs浓度，并计算非加权和（unweighted SUM），记作EVSUM5。结果发现对五种EVs亚群的浓度总和EVSUM5可以实现100%准确度的NPC诊断。与之相比，血浆EVs的总浓度和临床诊断的金标准VCA-IgA抗体区分NPC与健康人的准确度仅为74.2%和75.6%。
作者紧接着对包含28例未知具体分期的血浆样本（包含14例NPC患者，14例健康人）进行盲检测试。最终，EVSUM5的灵敏度、特异度及准确度可分别达到92.9%，100%及96.3%。这一结果验证了EVSUM5在鼻咽癌早期诊断中的有效性和准确性。
此外，作者也考察了EVSUM5及另外标志物组EVSUM2（仅为LMP1+ EVs与LMP2A+ EVs的浓度和）区分NPC，NPG及健康人的能力。作者对23例NPG患者血浆中五种EV亚群的浓度进行了表征，在三组临床样本中进行两两比对，并计算各个标志物的ROC曲线及其下的AUC值，得出以下结论：1）在区分NPC和NPG患者时，EVSUM5仍然具有各标志物中最高的准确度，为83.1%；2）而当区分鼻咽炎与健康人时，EVSUM2则具有更高的准确度，为82.6%；3）而VCA-IgA的准确度分别为73.8%和76.2%。
参考文献：Noninvasive Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma Based on Phenotypic Profiling of Viral and Tumor Markers on Plasma Extracellular Vesicles, Anal Chem. 2022 Jun 30. doi: 10.1021/acs.analchem.2c01311.
