口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的口腔癌类型，死亡率约为50%。通常，OSCC是在患者进入癌症中期和晚期时被诊断出来的。唾液不仅具有非侵入性、方便取样、直接处理和低成本的特征，还可以直接反映口腔环境、生理和病理状况，因此特别适合于研究口腔疾病。细胞外囊泡(EVs)的多功能膜结构可以保持其货物的稳定性，并有效降低体液的复杂性，这使得EVs的分析在早期检测和监测疾病状态方面具有吸引力和前景。然而基于唾液EVs的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的发展由于不能有效、快速和可重复地从唾液中捕获EVs而受到严重阻碍。为此，东南大学陶纬国教授团队介绍了一种基于唾液EVs蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析的快速和非侵入性策略，以区分OSCC患者和健康对照组，并探索评估OSCC患者治疗性能的可行性，相关内容以“Proteomic and phosphoproteomic landscape of salivary extracellular vesicles to assess OSCC therapeutical outcomes”为题于2022年12月27日在线发表在Proteomics杂志上。
首先该团队基于一种新的双功能化磁珠(BiMBs)分离了唾液EVs。使用光谱方法、免疫测定和质谱(MS)证明了高分离效率和特异性，使得下游EVs蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析成为可能。将来自30名OSCC患者和30名匹配的健康对照者的唾液样本随机分配到三组(每组10个样本)。在对OSCC患者和健康对照者的唾液EVs进行定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析后，进行了基于平行反应监测和平行累积-串联片段化(prm-PASEF)的靶向蛋白质组学研究，以测量手术切除前后收集的唾液EVs的蛋白质和磷酸化蛋白质组，发现了6种对口腔手术具有敏感反应的蛋白质和磷酸化蛋白质。
图1从唾液EVs中发现蛋白质和磷酸化蛋白生物标志物以评估手术结果的策略概述。
图2 BiMB法检测唾液中EVs的特性及BiMB法和超速离心法捕获效率的比较。
如图2B所示，通过BiMBs分离得到的唾液EVs保持完整，通过TEM可以清楚地观察到原始膜和三维结构；图2C NTA数据显示，从1mL唾液中洗脱的唾液EVs的平均直径为139.5nm，粒径数目为8.0 × 1010 。图2D通过WB实验，使用BiMBs从EVs中分离的EV标记蛋白：CD9、TSG101和CD81的强度是超速离心法的4倍以上。这些结果证明了BiMBs对唾液EVs的有效捕获，并且该方法对于下游蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析具有明显的优势。
图3 OSCC患者和健康对照者唾液EVs的定量蛋白质组学。
图3A和3B中显示116个总蛋白被上调，另外199种通过t-检验排除的、仅在患者组中鉴定的蛋白质也可以被定量到上调蛋白质中，GO分类显示，这315个全蛋白中的大多数属于胞质囊泡腔、膜封闭腔、细胞外间隙、胞吐作用和肿瘤坏死因子介导的/MAPK级联/NIK/NF-kappaB/Wnt信号通路，以及抗原加工和通过MHC类呈递外源肽抗原(TAP依赖性)。KEGG通路分析表明，这些蛋白质与趋化因子信号通路、ECM-受体相互作用、PI3K-Akt/ PPAR信号通路以及癌症中的蛋白聚糖有关。在这些上调的总蛋白中，许多蛋白如IGF-II、MMP1、MMP3、MMP13、EBP-1、uPA、FSCN1、CA-II、CD44、HMGCS2、PAI-1等先前已被报道与OSCC相关。此外，以前还发现一些蛋白质与肺癌、膀胱癌、SARS、口腔粘膜下纤维化、结肠直肠癌、宫颈癌和肾癌有关。
图4 OSCC患者和健康对照者唾液EVs的定量磷酸化蛋白质组学。
如图4A火山图和4B热图所示，代表121种磷酸化蛋白的250种磷酸化肽段被定量上调。仅在患者组中鉴定的另外11种磷酸化蛋白也可以通过运行之间的匹配进行定量，这132种磷酸化蛋白主要与质膜、细胞连接、tau蛋白结合、MAPK活性激活、MAP /蛋白酪氨酸/蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、端粒酶活性调节有关，并与早期内体到晚期内体转运的调节有关。KEGG途径分析表明，这些磷酸化蛋白参与癌症中蛋白聚糖/胆碱代谢的调节，以及Rap 1/ErbB/趋化因子/PI3K-Akt/mTOR/HIF-1信号通路，甚至参与几种癌症类型。
图5评估治疗结果的靶向蛋白质组学。
该团队使用prm-PASEF结果中选择的所有量化的全蛋白和磷酸化蛋白来筛选特征蛋白(图5A)，从中鉴定出10种蛋白(绿色)，这10种蛋白从手术前到手术后状态有明显变化(图5B)。为了通过考虑样本的个体差异来进一步评估唾液蛋白对手术结果的有效性，该团队量化了每个个体患者手术前后这十种蛋白的变化以及这些蛋白的量化强度的相应热图。在这10种蛋白中，包括3种全蛋白(HEP2、NHERF-2和MMP25)和3种磷酸化蛋白(PGM 1、ACLY和KPCD)在内的6种蛋白，这6种蛋白对口腔手术具有敏感反应，临床表现在拥有这6种蛋白的10名患者中至少有8名对口腔手术敏感。图5D显示了单个患者手术前后四种选定的全蛋白和磷酸化蛋白的强度变化。这些潜在的和用于评估手术结果的全蛋白和磷酸化蛋白的生物标志物曾与OSCC和/或其他癌症类型相关联，这突出了该研究对于具有巨大临床前景的疾病的非侵入性监测的强大潜力。
