近日，Nature Biotechnology杂志上发表一篇论文，介绍了一种单颗粒分析方法，可以提供关于大小在5-200 nm之间的成千上万个颗粒的内容物和生物物理特性的单颗粒信息。作者使用他们的单颗粒分析仪来测量脂质纳米粒子的信使RNA封装效率、不同纳米抗体的病毒结合效率以及脂质体、脂蛋白、外泌体和病毒的生物物理异质性。
生理的纳米级颗粒对于人体的健康和疾病非常重要。例如，脂蛋白（5-80nm）通过运输脂质来维持细胞代谢；细胞外囊泡（EVs，<200nm）参与免疫反应、细胞间通信和信号传导；平均大小为100-200nm的病毒会引起各种疾病。此外，合成的脂质体和脂质纳米颗粒（LNPs）广泛用于药物传递和疫苗。现有的研究生物颗粒的方法依赖于生化分析、质谱分析、全内反射荧光显微镜和传统流式细胞术。全内反射荧光显微镜以真正的单粒子方式提供了极佳的信噪比；然而，它需要将囊泡固定在表面上，并产生低通量数据。流式细胞术是一种高通量方法；然而，它通常只适用于细胞大小的物体。最近，有人尝试使用流式细胞术分析小型EVs，并正在开发依赖于微流控设备的“纳流”设备。这些方法仍然局限于平均颗粒大小>200nm，并需要专用且通常昂贵的设备。
该研究报道的单粒子分析（SPP）是一种新的方法，用于分析溶液中数千个扩散粒子的荧光波动。该方法使用商用共聚焦显微镜记录，可以用于测量小于200nm的单纳米级粒子的荧光强度。这些信息可用于颗粒物质量测量和生物物理学分析。SPP与流式细胞术类似，但是可以更好地分析小于200nm的颗粒。SPP通过分析荧光波动，可以识别多个通道中的强度峰值，并构建密度图和直方图。这种方法可以用于颗粒物质量测量和生物物理学分析。
用于纳米颗粒内容物分析的SPP
这篇论文的作者使用了一种叫做SPP的技术来测量脂质体中的颜色分子。他们制备了负载绿色分子和/或红色分子的脂质体，这些分子被并入脂质膜中。单重或双重（仅绿色染料，仅红色染料或两者）证实了我们的方法适用于内容分析。为了测试SPP可以访问的内容差异，作者改变了脂质体中绿色（FAST DiO）和红色（Abberior Star Red DPPE）信号的比例（1:1、1:2、2:1和1:3），发现这些变化被SPP成功捕捉到。
在SPP测量中，每个峰都会根据其亮度、宽度和与另一种颜色的共存情况进行分析。峰亮度可以用于确定粒子的聚类情况，并与峰宽度分析相结合，可以检测到少量大颗粒或聚集物的存在。此外，同一峰在多个通道中的共存以及相应强度的分析提供了有关粒子内容的信息。传统的共扩散分析无法在异质样品中稳健地评估共存，因为单个亮峰（代表样品中的大尺寸杂质）会使交叉相关分析失真。为了利用SPP的这一优势，将其应用于两个生物挑战，测量（1）LNPs中信使RNA（mRNA）封装效率和（2）抗体与病毒颗粒的结合。
SPP测定纳米级生物颗粒的生物物理特性
结果发现，与传统的基于RNA结合染料的大量测量方法相比，SPP技术可以更准确地测量LNP中mRNA的封装效率；SPP技术可以更准确地测量不同纳米抗体与病毒颗粒的结合效率，并且可以在单个颗粒水平上测量这种结合。
该研究提出并验证了一种高通量SPP分析方法，展示了SPP可以在单颗粒和高通量的方式下研究纳米生物颗粒的内容和生物物理特性；使用统计分析可以研究样品异质性；并且可以获得多个参数（例如扩散和流动性）进行聚类分析。使用这些SPP的特点来研究LNPs的mRNA封装效率、纳米抗体的病毒结合效率以及纳米生物颗粒的生物物理异质性。这种方法基于商业化和高度可访问的共聚焦系统，具有广泛的适用性，可以解决纳米生理颗粒的内容和组织问题。SPP不需要专用设备，并且由于共聚焦系统的探测器灵活性，不受固定光谱区域的限制。SPP提供了关于纳米生物颗粒的脂质和蛋白质含量、生物物理参数和多分散性的信息，这可以揭示这些颗粒在健康和疾病中的作用。
参考文献：Sych T, Schlegel J, Barriga HMG, Ojansivu M, Hanke L, Weber F, Beklem Bostancioglu R, Ezzat K, Stangl H, Plochberger B, Laurencikiene J, El Andaloussi S, Fürth D, Stevens MM, Sezgin E. High-throughput measurement of the content and properties of nano-sized bioparticles with single-particle profiler. Nat Biotechnol. 2023 Jun 12. doi: 10.1038/s41587-023-01825-5. PMID: 37308687.
