2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种常见的肥胖疾病，是以胰岛素抵抗和胰岛素相对缺乏而引起的血糖水平升高为特征的慢性代谢性疾病。T2DM会对患者自身其他组织的生长和修复造成影响，特别是对于骨组织。临床数据表明，在T2DM病理条件下，骨折愈合会发生延迟。巨噬细胞在骨折愈合中发挥着关键作用，其可通过经典途径激活为M1型，加剧炎症反应抑制骨愈合，亦可通过替代途径激活为M2型，消除炎症反应促进骨修复。研究发现，在T2DM骨微环境中，M1型巨噬细胞比例增多（M2型巨噬细胞比例减少）是导致骨折延迟愈合的重要原因。因此，提高M2型巨噬细胞比例有利于加速T2DM骨折愈合。外泌体是细胞分泌的一种细胞外囊泡，具有极低的免疫原性和较高的生物活性，广泛参与细胞之间的通讯交流。最近研究表明，M2型巨噬细胞来源外泌体可诱导M1向M2型巨噬细胞转变，但其具体机制仍不清晰。此外，M2型巨噬细胞外泌体干预T2DM骨折愈合的研究鲜有报道。
近期，上海大学转化医学研究院苏佳灿教授团队在科爱出版创办的期刊 Bioactive Materials 上联合发表题为“M2 macrophage-derived exosomes promote diabetic fracture healing by acting as an immunomodulator”的研究论文（2023 Jun 1;28:273-283），发现M2外泌体可作为一种免疫调节剂，通过激活M1型巨噬细胞中PI3K/AKT信号通路促进其向M2型巨噬细胞极化，改善骨免疫微环境，进而加速T2DM骨折愈合。文章第一作者为上海大学转化医学研究院2020级硕士研究生王一力。该研究获国家自然科学基金重大研究计划集成项目、国家自然科学基金重点项目等资助。
在这项研究中，作者首先提取了M2外泌体，并利用它们干预糖尿病骨折的骨修复。结果表明，M2外泌体通过降低M1型巨噬细胞比例进而调控骨免疫微环境，从而加速糖尿病骨折愈合。作者进一步证实M2外泌体通过激活PI3K/AKT信号通路诱导M1型巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞。该研究为M2外泌体促进糖尿病骨折愈合提供了新的视角和潜在的治疗方法。
M2外泌体通过PI3K/AKT信号通路调控巨噬细胞极化加速T2DM骨折愈合示意图
图1：T2DM小鼠骨折延迟愈合。（A）8周龄雄性正常小鼠与T2DM小鼠的对比图。（B）正常小鼠和T2DM小鼠骨折手术后不同天数的X射线图像。（C）骨折后股骨的Micro-CT代表性三维重建图像。（D）正常小鼠和T2DM小鼠骨折后不同天数骨痂指数分析。（E-F）股骨骨痂的Micro-CT定量分析，包括BV和BV/TV。（G-H）番红固绿染色及软骨区域定量分析。
作者首先选择8周龄db/db（T2DM）和C57BL/6J（Control）小鼠构建股骨骨折模型，随后使用X射线扫描及micro-CT分析T2DM骨折愈合中的骨修复能力。结果表明，T2DM小鼠骨折易发生延迟愈合，其特点是软骨痂和桥梁骨痂形成受阻、软骨痂矿化延迟以及骨痂重塑滞后。
图2：T2DM骨折愈合中巨噬细胞极化失衡。（A）M1型（F4/80和iNOS双阳性）巨噬细胞免疫荧光染色。（B）M1型（F4/80和iNOS双阳性）巨噬细胞的定量。（C）M2型（F4/80和CD206双阳性）巨噬细胞免疫荧光染色。（D）M2型（F4/80和CD206双阳性）巨噬细胞的定量。（E）qRT-PCR检测对照组与T2DM小鼠CD86、iNOS、IL-1β和TNF-α的mRNA表达。（F）qRT-PCR检测Control与T2DM小鼠CD206、Arg-1、CD163和IL-10的mRNA表达。
作者采用免疫荧光染色方法研究骨折术后7天骨痂处的M1和M2型巨噬细胞的表达情况。结果表明，T2DM小鼠在骨折术后7天时，M1型巨噬细胞增多，M2型巨噬细胞减少，骨愈合过程仍处于较高的炎症状态。
图3：M2外泌体制备与表征。（A）M2外泌体的制备示意图。（B）透射电镜观察M2外泌体的形貌。（C）NTA检测M2外泌体的粒径分布。（E）WB检测M2外泌体标志蛋白。（F）共聚焦显微镜观察M1型巨噬细胞对Did标记的M2外泌体的摄取情况。
随后，作者通过超速离心法从M2型巨噬细胞的培养上清中制备M2外泌体，并用TEM、NTA和WB进行表征。此外，M1型巨噬细胞也可高效摄取M2外泌体。
图4：M2外泌体促进巨噬细胞重编程和成骨。（A）qRT-PCR检测不同浓度的M2外泌体处理M1型巨噬细胞后CD206、Arg-1、IL-10和CD163的mRNA表达水平。（B）WB分析M1和M2型巨噬细胞标志物。（C）免疫荧光分析M1和M2型巨噬细胞标志物。（D）流式细胞术分析评估M2型巨噬细胞标志物。（E）BMSCs的ALP染色的代表图像。（F）ALP染色定量分析。（G）BMSCs的ARS染色的代表图像。（H）ARS染色定量分析。（I-J）qRT-PCR分析RM2巨噬细胞上清液处理后的BMSCs中BMP-2、Runx2、Osterix和OCN的mRNA表达水平。
作者在体外分别采用qPCR、WB、IF和FCM探究M2外泌体对巨噬细胞极化的影响。结果显示，M2外泌体可以促进M1型巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞，且M2外泌体具有较好的促成骨潜力。
图5：RNA测序显示M2-外泌体通过PI3K/AKT信号通路促进巨噬细胞极化。（A）RM2巨噬细胞中差异基因的GO生物学过程分析结果。（B）RM2巨噬细胞中差异基因的KEGG分析结果。（C）聚类热图显示M1和RM2巨噬细胞PI3K/AKT信号通路相关基因表达。（D）GSEA显示RM2巨噬细胞中PI3K/AKT信号通路基因富集评分显著增加。（E）WB分析显示PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的蛋白表达。
随后，为探究M2外泌体促进巨噬细胞重编程的分子机制，作者进行转录组测序分析。结果显示，M2外泌体主要通过激活M1型巨噬细胞中PI3K/AKT信号通路促进其转变为M2型巨噬细胞。
图6：M2外泌体在体内促进糖尿病骨折愈合。（A）骨折后股骨的Micro-CT代表性三维重建图像。（B-C）股骨骨痂的Micro-CT定量分析，包括BV和BV/TV。（D）M2型巨噬细胞免疫荧光染色。（E）M2型巨噬细胞的定量分析。
图7：（A-C）对照组、T2DM组、T2DM+M2外泌体组和T2DM+M2外泌体+LY294002组骨折区域的H&E、番红固绿和马松染色。
最后，作者在体内验证M2外泌体主要通过激活M1型巨噬细胞中PI3K/AKT信号通路，促进其转变为M2型巨噬细胞，进而加速T2DM骨折愈合。
通讯作者简介：
苏佳灿，现任上海交通大学医学院附属新华医院骨科主任，主任医师，教授，博士研究生导师，兼任上海大学转化医学研究院院长，临床医学博士，材料学博士后，国家重点研发计划重点专项首席科学家，军委科技委重点专项首席科学家，上海市卫生系统优秀学科带头人，上海市青年科创英才。担任上海青年科技人才协会副会长，上海医药卫生青年联合会副主席、上海医师志愿者联盟理事长等。
科研工作以第一申请人获得国家重点研发计划重点专项、军委科技委重点专项、国自然重点项目、国自然重大研究计划重点项目、国自然重大研究计划集成项目，国自然重大国际合作等科研项目20余项近8000余万元，第一完成人获省部级二等奖以上奖励4项，第一及通讯作者发表SCI论文100余篇，总影响因子>800分，包括Advanced materials、 Nano today、Advanced Functional Materials、 Advanced Science、JACS、ACS Nano、Science Advances、Small、Bone research、Nano letters、Biomaterials 等。授权国家专利30余项，主编主译20部专著。
学术兼职：担任中国医师协会骨科医师分会骨质疏松学组副组长，中华医学会骨科分会骨质疏松学组委员，中国医师协会骨科医师分会青年骨质疏松学组组长，中华医学会青年骨质疏松学组组长，中国生物医学工程学会组织工程与再生医学委员会常委委员，中国生物材料学会再生医学分会委员，中国生物材料学会青年委员会委员，中国医师协会急救复苏专委会委员，中国医师协会急救复苏专委会创伤学组主任委员，中国老年学会老年病学分会副会长，中国老年学会老年病学会骨科专委会主任委员，全军骨质疏松与康复专委会副主任委员，全军基础与转化医学专委会副主任委员，上海市中西医结合学会骨质疏松专委会主任委员， 上海市医学会骨科分会创伤学组委员，上海市医师协会骨科医师分会委员等。
获第20届中国五四青年奖章提名，首届全国向上向善好青年，第十七届上海市十大杰出青年，首届上海市青年英才科创奖，上海市五四青年奖章，上海市银蛇奖，上海市育才奖，上海市高校青年教师教学比赛一等奖，全国高等医学院校教学比赛一等奖，总后勤部院校教学标兵、总后勤部爱军精武标兵等奖项，荣立解放军个人二等功、三等功各1次。
参考文献：
M2 macrophage-derived exosomes promote diabetic fracture healing by acting as an immunomodulator. Bioactive Materials, 2023 Jun 1;28:273-283.
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