外泌体作为液体活检生物标志物，在癌症诊断中具有巨大的潜在价值。然而，传统的外泌体绝对浓度指标结果易受到多种临床因素（例如：个体差异、药物服用或样本处理过程）的影响，导致检测结果无法反映临床样本真实的病理生理状况。相较而言，肿瘤外泌体相对丰度指标在外泌体总浓度波动时依旧保持相对稳定，能够更为稳健地区分临床肿瘤样本。
近日，清华大学深圳国际研究生院孙树清教授团队在国际权威期刊Biosensors and Bioelectronics上发表题为“CRISPR/Cas12a and aptamer-chemiluminescence based analysis for the relative abundance determination of tumor-related protein positive exosomes for breast cancer diagnosis”的研究成果（2024 May 11:259:11638）。该研究通过CRISPR/Cas12a和化学发光技术实现了样本中肿瘤外泌体相对丰度指标的快速测定，为基于外泌体的癌症精准诊断提供了一种具有重要应用价值的新路径。该论文第一作者为博士研究生官晓天，通讯作者为孙树清教授。
这项研究设计了一种基于CRISPR/Cas12a和适配体化学发光的分析策略（CACBA），用于测定肿瘤相关蛋白阳性外泌体的相对丰度。具体而言，首先用CD63适配体和触发核酸序列（Trigger）修饰的磁珠捕获样本中的外泌体，随后与酶联EpCAM适配体（或MUC1适配体）结合。通过基于CRISPR/Cas12a的方法，将磁分离后含有游离Trigger的上清液用于外泌体总浓度的检测。同时，采用基于化学发光的方法，通过形成的“磁珠-外泌体-标记酶”夹心复合物用于EpCAM（或MUC1）阳性外泌体浓度的检测，原理如图1所示。EpCAM（或MUC1）阳性外泌体的相对丰度结果即可通过公式得出：肿瘤相关蛋白阳性外泌体相对丰度=肿瘤相关蛋白阳性外泌体浓度/外泌体总浓度×100%。
图1：基于CRISPR/Cas12a和适配体化学发光的肿瘤外泌体相对丰度分析策略
在相关研究中，实现肿瘤外泌体浓度的定量分析至关重要，因为浓度指标提供了一个可以在不同研究中进行结果比对的通用标准。然而，在以前大多数报道中，肿瘤外泌体的检测结果都以相对荧光强度来表示，由于非标准化的实验条件，限制了这些结果的通用性。这项研究通过结合外泌体的纳米颗粒跟踪分析（NTA）和纳米流式分析（nFC）结果，将肿瘤外泌体的测定数据转换为浓度单位，为非标准化实验条件下检测结果的跨研究比对提供了一种有效途径。
研究团队对该策略的关键性能进行了全面评估，实验结果表明该方法具有优异的灵敏度、特异性和抗干扰性能，能够高效区分乳腺癌细胞（MCF-7）和非乳腺癌细胞（MCF-10A）来源外泌体。通过对血浆样本进行梯度稀释，EpCAM和MUC1阳性外泌体相对丰度回收率分别为101.66%–111.21%和96.42%–104.85%，证实了在绝对浓度波动时，相对丰度指标的稳健性优势（图2(a)和(b)）。临床试验结果表明，与以往肿瘤外泌体绝对浓度指标相比，相对丰度指标能够更有效地区分乳腺癌样本（图2(c)）；与传统乳腺癌标志物（CEA/CA15-3）相比，肿瘤相关蛋白阳性外泌体相对丰度（EpCAM(+)%/MUC1(+)%）联检显示出更高的符合率（图2 (d)），初步证实了该策略在复杂临床条件下的应用潜力。
图2：血浆稀释回收：(a)EpCAM和(b)MUC1阳性外泌体相对丰度结果；临床试验ROC结果：(c)相对丰度与绝对浓度指标比对及(d)与传统肿瘤标志物比对
该究开发了一种基于CRISPR/Cas12a和适配体化学发光的分析策略（CACBA），用于测定肿瘤相关蛋白阳性外泌体的相对丰度，以实现乳腺癌的精准诊断。该方法具有灵敏度高、特异性强、抗干扰能力强、稳定性好、回收率稳定、制备简便等优势，可对肿瘤来源的外泌体进行多重分析，为癌症诊断提供了一种理想工具。同时，这项工作实现了特定蛋白阳性外泌体的定量浓度测定，为非标准化实验条件下的结果比较提供了通用标准。与传统肿瘤标志物相比，CACBA策略在临床样本诊断中具有更高的准确性，相对丰度测定可高效区分乳腺癌样本。此外，通过改变适配体序列，该策略可以快速扩展到其他肿瘤类型外泌体的测定。因此，这种CACBA策略为基于外泌体的癌症临床诊断提供了一种有前景的新途径。
参考文献：
CRISPR/Cas12a and aptamer-chemiluminescence based analysis for the relative abundance determination of tumor-related protein positive exosomes for breast cancer diagnosis. Biosens. Bioelectron. 2024, 259, 116380.
https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116380
外泌体资讯网 Biosens Bioelectron｜清华大学深圳国际研究生院孙树清：基于CRISPR/Cas12a和适配体化学发光技术的肿瘤相关蛋白阳性外泌体相对丰度检测用于乳腺癌诊断
