细胞外囊泡作为液体活检生物标志物，在癌症诊断中有巨大的潜在应用价值。卵巢癌（OvCa）由于其高死亡率和缺乏有效的早期诊断方法，对女性健康构成了严重的威胁。有证据表明，携带来自OvCa的细胞特异性成分的纳米级小细胞外囊泡（sEVs）可以作为潜在的诊断生物标志物。然而，开发一种能够快速、有效、灵敏地检测纳米级sEVs的液体活检技术，对于实现卵巢癌的早期和准确诊断具有重要意义。近日，海南医科大学急救与创伤教育部重点实验室于法标团队在Elsevier期刊Biosensors and Bioelectronics上发表题为“Sensitive phenotyping of serum extracellular vesicles on a SERS-microfluidic platform for early-stage clinical diagnosis of ovarian carcinoma”的研究成果（2024 Sep 7:267:116724）。该研究通过设计一种表面增强拉曼散射（SERS）-多通道芯片检测sEVs（S-MMEV）的方法来研究sEVs的表型变化，实现了通过对sEVs的表型进行分析成功区分健康人群和卵巢癌患者，同时对早期卵巢癌患者进行精准诊断。为基于小细胞外囊泡的癌症早期诊断提供了一种具有重要应用价值的新路径。
如图1所示，该研究设计的微流控芯片由7个微通道组成，可以平行检测多个生物标志物，从而提高检测的准确性。基于Au@Ag纳米粒子缀合拉曼报告分子MGITC，以及能识别sEVs表面生物标志物的抗体制备SERS探针，通过特异性识别sEVs膜表面不同的生物标志物，包括通用的EV生物标志物（四跨膜蛋白：CD9、CD81）和OvCa肿瘤生物标志物（EpCAM、CD24、CA125、EGFR），该团队成功分析了细胞培养液及临床样本中sEVs的表型变化（以IgG作为对照），并实现了OvCa患者（包括I-II期的早期患者）与健康对照的准确区分，该方法具有高灵敏度、高特异性，AUC值可达0.9467。图1：基于S-MMEV检测sEVs表型变化对卵巢癌临床诊断的工作机制示意图微流控芯片的设计、结构及修饰如图2所示。该微流控芯片是基于带有7个平行微通道PDMS层和金纳米膜层结合到玻片的设计。7个微通道入口处有储液池，通过多通道微流控泵从通道出口处抽拉的方式导入液体。微通道内首先通入捕获抗体（抗CD63）进行修饰，之后通入相同批次、相同浓度和体积的sEVs，在使用BSA结合未反应表面后通入SERS纳米探针进行识别。通过检测各个微通道中SERS纳米探针的信号强度反应出sEVs表面不同生物标志物的表达量，以六种生物标志物的信号强度直观展现出sEVs的表型变化。研究团队对S-MMEV方法中涉及的SERS探针的稳定性和检测灵敏度进行了评估，实验结果表明该方法具有优异的灵敏度和特异性，能够高效区分正常以及卵巢癌细胞培养液来源的sEVs。该团队进一步将该技术应用于临床样本的检测，以验证其在早期诊断中的应用。研究中采用了36例临床样本，包括10例健康对照（HC），15例早期OvCa（I-II期），7例晚期OvCa（III-IV期）和4例术后OvCa患者。图3A中对36例临床样本来源的sEVs进行S-MMEV检测后的热图结果显示，在临床样本中六种sEV的生物标志物有不同的丰度。小提琴分析结果（图3B）显示，当单独使用每个sEV生物标志物时，HC和OvCaP I-II之间的检测值差异有统计学意义（P < 0.0001）。HC与OvCaP III-IV、OvCaP AO比较时，肿瘤生物标志物（EpCAM、CD24、CA125）（图3B iii，v，vi）均差异显著（P < 0.0001），而EGFR差异较高（P < 0.001）。进一步通过采用受试者工作特征（ROC）分析了S-MMEV法检测各生物标志物和联合生物标志物的敏感性、特异性和曲线下面积（AUC）在区分正常对照组和癌症者时的作用（图3C）。结果显示，单一生物标志物的使用（图3C i-vi）其AUC值均不及外泌体通用蛋白与肿瘤标志物蛋白结合使用的值，而当使用六种生物标志物时，AUC值无论是在区分HC和OvCa (I-II)还是在区分HC和OvCa (III-IV及AO)均高于0.94。尤其是在比较HC和OvCa(I-II)时，其灵敏度为1.00,准确度为0.95，AUC值达0.9467。图3：OvCa蛋白生物标志物的分子图谱分析。(A)每个生物标志物的表达被归一化并显示。(B)图3A所示数据的小提琴数据分析。OvCa评分在I期到IV期OvCa患者中高于健康对照，但在OvCa队列中显示出相似的结果（*P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001）。(C)健康对照组与OvCa患者之间不同生物标志物、每个个体生物标志物（i-vi）、5个EV生物标志物（CD9或CD81）和肿瘤生物标志物（EpCAM、EGFR、CD24和CA125）（vii和viiii）以及所有6个联合生物标志物的ROC曲线（ix）。因此，该研究通过设计一种SERS-多通道芯片用于检测sEVs（S-MMEV）对sEVs的表型变化进行研究，实现了通过对sEVs表型进行分析成功区分健康人群和OvCa患者，同时对早期OvCa患者进行了区分。该方法具有灵敏度高、特异性强，平行通道的设计有效避免了不同表型标志物的干扰等优势，为卵巢癌早期诊断提供了一种理想工具。与传统的检测方法相比较相比，S-MMEV策略在临床样本诊断中具有更高的准确性和敏感性，样本量消耗少。此外，该研究开发的方法不局限于卵巢癌的检测，可通过设计结合识别不同肿瘤生物标志物的SERS探针来实现对其他肿瘤的早期精准诊断。Sensitive phenotyping of serum extracellular vesicles on a SERS-microfluidic platform for early-stage clinical diagnosis of ovarian carcinoma. Biosensors & bioelectronics, 2024，267，116724, doi:10.1016/j.bios.2024.116724外泌体资讯网 BIOSENS BIOELECTRON｜：基于SERS -微流控平台对血清细胞外囊泡的灵敏表型分析用于卵巢癌早期临床诊断
