目前对于细胞外囊泡的研究涉及多个领域，包括生化研究、富集策略、分析检测、疾病诊断以及载药治疗等，细胞外囊泡 miRNA 由于其较强的稳定性能抵抗 RNA 酶的降解且与癌症的发展密切相关，因此肿瘤来源的小细胞外囊泡微小RNA（sEV miRNA） 被认为是基于液体活检的癌症诊断的有前途的生物标志物。 对于 miRNA 的检测方法也是各种各样，比如 RT-qPCR、NGS检测，这些方法需要对sEV进行裂解，面临耗时耗力、RNA降解和污染的挑战，膜渗透、脂质体融合递送探针等原位检测方法需要制备结构稳定的探针或者囊泡结构，操作比较复杂，检测效率不高。针对以上问题，上海交通大学医学院附属仁济医院李敏、王鹏飞团队联合重庆大学罗阳团队在Analytical Chemistry杂志上发表题为“In Situ, Fusion-Free, Multiplexed Detection of Small Extracellular Vesicle miRNAs for Cancer Diagnostics”的论文(doi: 10.1021/acs.analchem.4c03129)，其主要开发了一种了基于胆固醇介导的分子信标，通过被运输到sEV中，可对miRNA进行原位、无膜融合、多重检测，以实现对前列腺癌、乳腺癌、胃癌的快速诊断。
在该工作中，作者通过将胆固醇与分子信标结合（MB-chol），以实现简单有效的将探针运输到sEV中，以无膜融合、多路复用方式原位检测miRNAs，并通过miRNAs图谱来实现癌症的诊断（图1）。（A）分离血清中的sEV（B）分子信标通过胆固醇介导的膜插入运输到sEV图2.表征和验证胆固醇介导的MBs原位检测sEV miRNAs（A,B）sEV-L和sEV-H的尺寸分布以及TEM形貌特征（C）蛋白免疫印迹分析细胞与sEV的蛋白标志物（D）胆固醇介导MBs运输到sEVs比MBs效率更高的示意图（E）实验表征MB21与MB21-chol原位检测sEV-L, sEV-H中miR-21的信噪比（F,G）共聚焦显微镜和流式分析sEV-L和MB21-chol反应后的样品（H,I）共聚焦显微镜和流式分析sEV-H和MB21-chol反应后的样品
首先表征和验证胆固醇介导的MBs原位检测sEV miRNAs（图2），对提取出来的sEV进行表征，得到纯度较高结构完整的sEV用于后续实验，探究了该方案的可行性以及胆固醇对检测效果的影响，通过MB21-chol与MB21分别对sEV miR-21检测的SNR比较，结果表明MB21-chol比MB21进入sEV的效率更高，且能区分肿瘤来源的sEV-L以及非肿瘤来源的sEV-H。同时也进行了共聚焦显微观察和流式分析，结果与上述一致。图3. 胆固醇介导MB 对sEV miRNA检测的实验条件优化（A）MB21-chol在sEVs存在或不存在下的荧光动力学检测（B）MB21-chol和sEV反应不同时间的SNR（C-F）验证温度、sEV浓度、MB21-chol浓度以及RNase处理对实验的影响并确定最佳实验参数（G）不同MB-chol检测合成的三种miRNA来验证其特异性（H）在一锅法中多重检测合成的3种miRNAs并正交性检验之后对实验的参数进行了优化，并探究了RNase消化处理sEV对实验是否有影响（图3），结果表明对sEV进行RNase消化与否，对实验的影响几乎不计。同时，也验证了探针的特异性，用带有不同荧光基团的3种MB-chol和人工合成的3种miRNAs进行正交性实验，结果表明所设计的探针具有较好的检测特异性，并且能够在一锅法中同时检测sEV中多种miRNAs。图4.通过MB-chol多重检测血清来源sEV miRNAs 用于癌症诊断（A）测量所有选定miRNA靶标临床样本的SNR值（B,E,H）分别为PCa、BCa、GCa与健康捐献者3种miRNAs表达热图（C,F,I）单个miRNA和3种miRNAs总和的ROC用于PCa、BCa、GCa的诊断（D,G,J）混淆矩阵分别总结基于MB-chol多重检测sEV miRNAs 对PCa、BCa、GCa的诊断性能。最后作者进行了临床样本的验证（图4），收集了一共66例前列腺癌、乳腺癌、胃癌和健康捐献者的血清，一锅法检测血清来源的sEV中特定miRNAs，得到相应的热图、ROC曲线以及混淆矩阵图，结果表明MB-chol探针检测 sEV miRNAs具有高灵敏度、特异性、准确性，并且发现前列腺癌、乳腺癌、胃癌的3种miRNAs联合诊断效果比单个miRNA的诊断准确度要高，分别达到了83.3%，81.8%，和100%。总之，这项研究开发了一种胆固醇介导分子探针对sEV miRNAs进行无破坏性、原位、无膜融合、无穿孔和多路复用检测的方法。用这种策略来检测前列腺癌、乳腺癌、胃癌和健康个体的血清sEV，能够成功区分健康个体和癌症患者，展示了该方法在临床诊断方面的巨大潜力。In Situ, Fusion-Free, Multiplexed Detection of Small Extracellular Vesicle miRNAs for Cancer Diagnostics. Analytical Chemistry, 2024. doi: 10.1021/acs.analchem.4c03129.外泌体资讯网 Anal. Chem｜上海交大附属仁济医院李敏/王鹏飞/重庆大学罗阳团队：原位多重检测小细胞外囊泡microRNAs用于癌症诊断
