细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）与供体细胞的生物信息保持着高度相似性。因此，EVs常作为非侵入性诊断的潜在肿瘤生物标志物，在疾病筛查以及预后评估中发挥着重要作用。目前，很多材料已经被开发出用于EVs的分离，虽然材料中存在许多孔径，但是其孔径范围均在微孔范围（< 2 nm），而EVs（50-200 nm）无法渗透到材料的微孔中。不仅无法发挥出其大比表面积的优势，而且小颗粒杂质会吸附在材料的微孔或中孔（2-50 nm）之中，对EVs的分离分析产生影响。苏州大学张海洋副教授、汪维鹏教授团队与西北大学卫引茂教授团队合作在Analytical Chemistry杂志上发表题为“Functional Three-Dimensional Zeolitic Imidazolate Framework with Order Macroporous Structure for Isolation of Extracellular Vesicles”的论文，主要介绍了一种基于SOM-ZIF-8-DSPE材料的EVs捕获方法，可从细胞培液以及临床血浆样本中快速地捕获EVs。相比于传统分离方法，该方法大大节省了捕获分离EVs所需的时间，且捕获的EVs在疾病探究领域具有很大的应用前景，从而解决了EVs捕获分离中成本高，步骤冗杂、以及回收率低等问题，在疾病无创监测和疾病早期筛查中提供了新途径。论文第一作者为硕士研究生徐放、博士研究生陈梦茜，通讯作者为张海洋副教授、卫引茂教授、汪维鹏教授。
该研究工作主要是以SOM-ZIF-8为基础框架材料，并通过氨基修饰后实现DSPE分子功能化得到SOM-ZIF-8-DSPE材料。其中，SOM-ZIF-8材料以单分散聚苯乙烯微球为模板，加入ZIF-8前驱体后在氨水作用下使其在模板上原位结晶形成多面体结构，将内部的微球模板溶蚀后，便制备出具有大孔结构的中空骨架的SOM-ZIF-8材料。SOM-ZIF-8材料中的大孔结构与囊泡尺寸匹配，为EVs提供更大的捕获空间，减少囊泡与材料之间的空间位阻，同时连续的孔道结构可以提高液相传质速率，实现EVs的快速捕获。借助SOM-ZIF-8材料提供广阔的金属螯合位点和DSPE分子的脂质锚定位点的协同作用，从而实现生物样本中高效、快速地分离出EVs。此外，基于SOM-ZIF-8-DSPE材料捕获方法分离出的EVs可以用于下游核酸分析，这为发现潜在的疾病生物标志物提供了有力的工具。图1. SOM-ZIF-8-DSPE材料的制备及其捕获EVs的示意图为了将捕获EVs效果可视化，作者从捕获效率、捕获稳定性以及与其他捕获方法进行比较来考察SOM-ZIF-8-DSPE材料捕获EVs的效果。如图2（A）所示，共聚焦图像表明成功地对UC法制备得到的EVs进行了绿色荧光标记，并且经SOM-ZIF-8-DSPE材料与荧光标记的EVs共孵育后，材料表面捕获了大量绿色荧光的EVs，同时在捕获后的剩余的上清体系中几乎没有观察到荧光EVs。在此基础上，作者通过WB实验对该捕获方法的回收率进行量化。如图2（B）所示，该方法对UC法制备的EVs样本的回收率仅有48%，同时上清液中也检测到许多EVs的蛋白残留。然而，对未经UC法处理的细胞培养液得到的样本回收率高达79.8%。这是因为使用UC法制备得到的EVs常常会彼此聚集，EVs团聚后导致样本里存在较多大尺寸的EVs，大尺寸的EVs被排阻于SOM-ZIF-8-DSPE材料之外，无法进入材料的大孔之中，导致材料难以与其产生有效的相互作用来实现EVs的捕获，因此回收率较低。相反，细胞培养液的EVs尺寸分布广，较少会产生颗粒间聚集，因此回收率较高。如图2（C-D)所示，作者借助扫描电镜也观察到材料能够捕获大量EVs。以上结果证实，EVs通过SOM-ZIF-8-DSPE材料的孔径进入内部大孔结构，并借助材料的螯合和DSPE的锚定作用将EVs富集于孔洞之中。图2. EVs捕获效率考察。（A）SOM-ZIF-8-DSPE材料捕获荧光标记EVs的荧光共聚焦图，（B）SOM-ZIF-8-DSPE材料捕获EVs回收率的WB图，（C-D）SOM-ZIF-8-DSPE材料捕获EVs前后的SEM图像此外，越来越多的证据表明miRNA在CRC的增殖和转移中有重要的作用。作者采用了微小RNA高通量测序（MicroRNA sequencing，miRNA-seq）对EVs的中miRNA进行检测分析。以3例正常志愿者、3例原发结直肠癌（Primary colorectal cancer，pCRC）以及3例mCRC（Metastatic colorectal cancer，mCRC）患者血浆为样本进行miRNA-seq分析。主成分分析结果如图3（A）所示，正常志愿者（N）血浆EVs的miRNA表达模式与pCRC（T）和mCRC（M）之间存在显著差异；同时，如图3（B-C）所示，在N、T以及M三组样本中分别检测到了168、139和106个miRNA，并且从聚类分析图中可以观察到3种不同类型EVs中miRNA的差异表达。图3. EVs的miRNA-seq结果。（A）主成分分析，（B）样本总miRNA维恩图，（C）差异表达基因的聚类分析图。其中N为正常志愿者；T为pCRC；M为mCRC。总结来说，作者开发了一种基于SOM-ZIF-8-DSPE材料的EVs捕获方法，可从细胞培液以及临床血浆样本中快速地捕获EVs。SOM-ZIF-8-DSPE材料中有序且互联互通的大孔结构增强了液体样本的渗透性以及内部的扩散性，使它们在捕获EVs时可以充分暴露活性位点从而进一步提高捕获效率。相比于传统分离方法，该方法大大节省了捕获分离EVs所需的时间，且捕获的EVs在疾病探究领域具有很大的应用前景，从而解决了EVs捕获分离中成本高，步骤冗杂、以及回收率低等问题，为疾病无创监测和疾病早期筛查提供了新途。Functional Three-Dimensional Zeolitic Imidazolate Framework with an Ordered Macroporous Structure for the Isolation of Extracellular Vesicles, Anal Chem. 2024 Oct 23. doi: 10.1021/acs.analchem.4c03566. 外泌体资讯网 Anal. Chem.｜苏州大学张海洋/汪维鹏团队：一种DSPE功能化三维有序大孔结构ZIF-8材料用于细胞外囊泡分离分析
