小细胞外囊泡（sEVs）内含来自原始细胞的核酸和蛋白质等生物标志物，是液体活检的理想标志物。由于sEVs体积微小且密度接近体液，在复杂生物样品中对其进行快速分离和检测仍存在挑战。微流控技术以其小型化、集成化、高通量、低样品需求和低试剂消耗等优势，为sEVs的分离和检测提供了新的手段。
目前，基于免疫亲和力的方法是微流控液体活检设备分离和检测sEVs的主要策略，通常在各种复杂微通道表面固定抗体来捕获sEVs。但由于抗体与sEVs表面蛋白的结合依赖于被动扩散，而微通道内普遍存在层流现象，导致传质效率较低，从而影响了检测的灵敏度和效率。
近期，吉林大学杨方教授和李桂英教授在Analytical Chemistry上发表题为“Small Extracellular Vesicles Detection by Dielectrophoresis-Based Microfluidic Chip Filled with Transparent Antibody-Conjugated Microbeads for Breast Cancer Diagnosis“的论文（2025, 18;97(10):5678-5687），主要介绍了一种将介电泳和免疫亲和相结合的acDEP-sEV免疫芯片，通过在芯片反应腔中填充抗体偶联微珠，构建非均匀电场，扰乱层流提高传质效率，聚焦荧光信号，最终实现快速灵敏、可调的sEVs捕获和检测。该方法仅需20−50 μL血浆样本，在不到35分钟内即可完成液体活检，检测限（LOD）为54 sEV/μL。文章共同第一作者为吉林大学硕士研究生兰梅、吴迪，通讯作者吉林大学杨方教授和李桂英教授。
研究思路与内容
1、芯片设计与制备
研究人员设计并制作了acDEP-sEV免疫芯片（图1）。在芯片的反应腔中填充透明抗体偶联微珠，使微珠单层充满反应腔，迫使液体只能从它们之间的缝隙流过。这种设计能够有效的扰乱层流，提高外泌体的捕获效率，并聚焦荧光信号，提高检测灵敏度。同时，在p-DEP力的作用下，sEVs主动向抗体偶联微珠表面移动，而不是单纯依靠被动扩散。这种主动运动不受流体传质边界效应的影响，使得固定在微珠上的抗体能够捕获更多的sEVs，显著提高了免疫捕获效率，从而有效地提高了sEVs的检测效率和灵敏度。
图1 acDEP-sEV免疫芯片示意图
2、功能验证
通过扫描电子显微镜（SEM）表征了抗体偶联微珠的成功制备。使用PKH67染色试剂盒提取的sEVs验证了acDEP-sEV免疫芯片捕获和检测sEVs的能力，结果显示芯片能够有效捕获sEVs。进一步使用MCF-7细胞培养上清液中的sEVs进行检测，与对照组（DMEM培养基）相比，检测组显示出更强的荧光信号，证明芯片能够在复杂样本中检测sEVs。
3、影响因素分析
该研究研究了频率、电压、样本体积和流速对sEVs捕获的影响。结果表明，在500 kHz、10 Vp-p的电场条件下，芯片对sEVs的捕获效果最佳。而且研究发现即使不使用注射泵，使用微量移液器将样本注入芯片反应室，芯片也能够有效捕获和检测sEVs。
4、性能评估
芯片在sEVs检测中表现出良好的重复性、稳定性和特异性。抗体偶联微珠在−20 °C下储存12周后仍保持良好稳定性。芯片能够特异性检测不同细胞系分泌的sEVs，如检测人胚胎肾细胞（HEK-293T）和两种乳腺癌细胞系（MCF-7和MDA-MB-231）培养上清液中的总sEVs和EpCAM阳性sEVs，结果显示癌细胞分泌的sEVs中EpCAM的含量显著高于健康细胞。、
5、检测限研究
通过校准荧光强度与sEVs浓度，得出acDEP-sEV免疫芯片的检测限为54 sEV/μL，显著提高了sEVs检测的灵敏度。
6、临床样本分析
研究通过检测10名乳腺癌患者和10名健康志愿者的血浆样本（图2），发现乳腺癌患者血浆中总sEVs、EpCAM阳性和MUC1阳性sEVs水平显著高于健康志愿者。而且发现多标志物联合评估具有极高的灵敏度、准确性和特异性。
图2 用于乳腺癌诊断的sEV生物标志物临床分析
结论：
该研究开发的acDEP-sEV免疫芯片结合了DEP和免疫亲和方法，能够快速、灵敏地检测sEVs。芯片具有良好的重复性、稳定性和特异性，检测限低至54 sEV/μL。在乳腺癌诊断中，多标志物联合评估显著提高了基于sEVs的诊断灵敏度和准确性。总之，该研究开发的基于DEP和免疫亲和相结合的sEVs液体活检装置，为sEVs在疾病诊断、治疗和预防中的研究和应用提供了一种新的方法和策略。
参考文献：
Lan, M. et al. Small Extracellular Vesicles Detection by Dielectrophoresis-Based Microfluidic Chip Filled with Transparent Antibody-Conjugated Microbeads for Breast Cancer Diagnosis. Analytical Chemistry 97, 5678-5687 (2025). https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c06592
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