在细胞外囊泡的研究中，有很多研究者以血浆或血清为研究对象。这就造成了在文章投稿的时候很容易被审稿人问到所研究的循环细胞外囊泡的细胞起源问题。由于血液成分复杂，所以血液中的细胞外囊泡的来源可能是多方面，诸如血细胞、内皮细胞以及其他脏器细胞来源的囊泡都会存在于血液中。因此，如何追溯循环细胞外囊泡的细胞起源是目前循环细胞外囊泡研究的一个需要考虑的问题。早期的研究很难解决这一问题，但是随着技术的进步，目前逐渐出现了一些追溯策略，值得我们了解和学习。
今天我们以发表在Journal ofExtracellular Vesicles上的一篇文章介绍一种追溯策略。《Functional andtranscriptomic analysis of extracellular vesicles identifies calprotectin as anew prognostic marker in peripheral arterial disease (PAD). 细胞外囊泡的功能和转录组学分析确定钙卫蛋白是外周动脉疾病（PAD）的新预后标志物》
在发达国家当中，周围动脉疾病（PAD）被认为是最普遍的血管疾病之一，在60岁以上的人群中，据估计，其患病率会随着年龄的增长而增加。该疾病影响20％以上的人，但在85岁以上的人群中这一比例骤然上升至50％。随着人口老龄化程度的不断加深，PAD在未来将为人口和社会造成严重的健康和经济问题。尽管目前临床诊疗中对PAD的危险因素进行了正确的药理控制，但PAD依旧在病程的全部阶段表现出与心血管血栓事件（中风和急性心肌梗塞）高发和死亡的密切正相关。这种情况促使我们寻找新的治疗目标和预后工具，以优化这些患者的诊断和治疗。
几乎所有类型的细胞都会释放细胞外囊泡（EVs），这些囊泡包含来自细胞或起源器官的蛋白质，核酸，脂质和糖。细胞外囊泡的内容物及其含量会受到特定病理生理条件的影响。细胞外囊泡通过触发靶细胞的应答并充当细胞间通讯的调节剂，有助于维持血管稳态。传统理论认为，根据其组织因子和磷脂酰丝氨酸含量，细胞外囊泡被描述为促血栓形成剂。此外，循环细胞外囊泡还可以转运被认为是细胞或起源器官的“分子印迹”（液体活检）的核酸和表面标志物。在心血管领域，细胞外囊泡已成为发现新生物标志物的潜在候选者，并与冠心病患者的血栓形成性和炎症性疾病有关。细胞外囊泡的作用也已在PAD中进行了研究，尽管程度较轻，但在研究内皮和白细胞衍生细胞外囊泡时，它们被假定为血小板活化标志物或血管生成和炎性分子的储库。
在这项研究报道中，作者们对功能，表型和基因组水平的循环细胞外囊泡进行了全面的研究，以期寻找到在PAD患者细胞和分子层面有价值的工具。因此，作者们首先确定了循环细胞外囊泡的数量和细胞起源及其血栓形成活性。其次，使用适应性的大规模平行RNA测序（MARS-Seq）研究了分离的中型/大型EV或微泡的转录组，并建立了用于测序数据生物信息学分析的流程。再次，在一大批对照组和PAD患者中测量了一种已鉴定基因（血清钙卫蛋白中的S100A9）的血清水平，以分析其作为预后指标的价值。最后，作者们确定了S100A9在股动脉粥样硬化斑块衍生的EV和局部，动脉组织样本中的表达。
文章主要以PAD患者的血浆细胞外囊泡为研究对象，着重寻找了与PAD疾病相关的血液相关标志物。证明了PAD患者循环细胞外囊泡的主要起源是血小板。这些结果一定程度上也解释了PAD疾病与血栓形成存在正相关的原因。这是一篇很不错的循环细胞外囊泡标志物研究报道，相关领域的朋友可以读一读原文，这里就不再赘述。
今天，我们主要关注文章中对循环细胞外囊泡的细胞起源的追溯策略。
目前的研究已经表明，细胞外囊泡通常包含有起源细胞的特定标志物。早先已有研究证实细可以通过检测细胞外囊泡表面的特定细胞标志物来推断细胞外囊泡的细胞起源，例如检测L1CAM在细胞外囊泡的存在来判断该囊泡是否来源于神经元。近些年这一思路得到了细胞外囊泡领域主流观点的认可。在这篇文章中，作者们证实了PAD患者循环细胞外囊泡的主要细胞来源是血小板。
得出这一结论的具体实验是利用Cytoflex（Beckman Coulter)超灵敏流式细胞仪进行囊泡的流式分析。通过染色不同的细胞特异性标志物，利用流式分析确认单个细胞外囊泡的来源，最终统计不同细胞来源的细胞外囊泡在血液中的比例。具体而言， APC anti-human CD41/61 识别血小板起源， PC7anti-human CD11b 识别白细胞起源，PerCP/Cy5.5 anti-human CD235a识别红细胞起源。相应IgG作为阴性对照抗体。最终获得如上图所示的不同细胞起源的循环细胞外囊泡比例。
类比于超速离心是细胞外囊泡分离方法的“金标准”，流式细胞仪分析细胞外囊泡表面标志蛋白来判断细胞起源，基本上算是分析细胞外囊泡来源方法的“金标准”了。当被审稿人问到循环细胞外囊泡的起源时，可以考虑使用此策略来回答问题。
关于Cytoflex超灵敏流式细胞仪
CytoFLEX是由贝克曼库尔特生命科学事业部推出的一系列流式细胞仪。它化繁为简，能应用于各类复杂的应用并适应各类型的检测样本。其可靠的采样和流体系统设计支持微量上样管的样本获取，样本上样体积最小达到10 ul。CytoFLEX在多参数应用中同样展现出强大实力，对微颗粒的检测大小极限可低至200 nm。既可以用于细胞外囊泡分析，也可以用于常规的细胞分析。
点击左下角阅读原文或扫二维码填写表单，送《流式细胞学：原理、操作及应用》共30本！
二维码：
或扫描下方二维码：
外泌体资讯网 怎样追溯血浆中细胞外囊泡的细胞起源
